prof_afv

prof_afv 15 минут на прочтение

ЖЖ рекомендует
Категории:

Открытие вируса гепатита С

Вместо введения

Началась «нобелевская неделя». По традиции первыми объявлены имена лауреатов премии 2021г в области физиологии и медицины. Признаюсь, к Нобелевским премиям по медицине я не испытываю особого пиетета. Количество действительно выдающихся научных достижений, на мой взгляд, явно недостаточно для ежегодного присуждения премии. Открытия, за которые она присуждается, далеко не равноценны по «научному калибру». Да и относятся они к настолько разным областям, что сравнивать их уровень порой невозможно. Некоторые из оговорённых в завещании Нобеля условий мне кажутся устаревшими и несправедливыми. Скажем, условие «не больше трёх лауреатов» оставило «за бортом» немало учёных, заслуживающих премию в неменьшей степени, чем получившие её лауреаты. Да и само официальное название премии «по физиологии и медицине» сейчас звучит архаично. Наконец, Нобелевский Комитет для меня, и думаю я не одинок, не является инкарнацией Высшей Научной Мудрости. Правда, политическая мотивация при присуждении премий по науке минимальна, чего не скажешь о ненаучных Нобелевских премиях. Но, как бы там ни было, так сложилось, что Нобелевская премия стала, выражаясь современным языком, самым «раскрученным» призом за научные достижения и, несомненно, лауреаты научных Нобелевских премий это всегда крупные учёные. Что касается Нобелевской премии этого года, то эта область исследований очень далека от границ моей профессиональной компетенции и от тематики этого блога. Но, благодаря напоминанию от ЖЖ «о посте год назад», я перечитал посты, посвященные Нобелевской премии по медицине прошлого года. Она была присуждена за открытие вируса гепатита С. Я, наверное, предвзят – область этой премии мне профессионально близка. Но это тот редкий случай, когда стандартные, для пост-премиальных комментариев, обещания «прорыва» в борьбе с той или иной болезнью реализовались. Мне показалось, что есть смысл повторить, посвященные этой премии посты годичной давности, с минимальными изменениями. Этот текст длиннее обычного, но история того стоит. 

Лауреаты премии 2020 и кто остался «за бортом»

Лауреатами премии в прошлом году стали Майкл Хоутон (Michael Houghton), Харви Альтер (Harvey Alter) и Чарльз Райс (Charles M. Rice). Жаль, что из-за правила «не больше трёх» премию не получили Qui-Lim Choo и George Kuo, также сыгравшие очень важную роль в идентификации вируса гепатита С и создании первых диагностических систем на этот вирус. Нужно сказать, что отношения между сегодняшними лауреатами не были безоблачными. Даже суды случались. Возможно, это одна из причин, почему Нобелевскую премию долго не присуждали. Но есть и другая причина (это только мои догадки, не более). Дело в том, что в идентификации гепатита С, как отдельного заболевания, так и его возбудителя (Hepatitis C virus – HCV), огромную роль сыграли эксперименты на шимпанзе. Впоследствии, под давлением защитников животных, они были полностью запрещены. Против этого запрета активно выступал «старейшина» этой группы лауреатов – Харви Альтер (Harvey Alter). В эпоху «политкорректности» подобная позиция, скажем так, не приветствуется. Но пора уже от «вокруг да около» перейти к сути.

Коротко о вирусах гепатита

Гепатит это воспаление печени. У этого воспаления могут быть разные причины, не обязательно вирусные. Более того, не все вирусы, поражающие, в числе прочего, печень, относят к вирусам гепатита. Вирусами гепатита называют те вирусы, основным «направлением» болезнетворного действия которых является воспалительное поражение печени (что не исключает некоторых вне-печёночных эффектов). В настоящее время известны пять «безоговорочных» вирусов гепатита человека (A, B, C, D, E) и ещё несколько «подозреваемых» вирусов, клиническое значение которых минимально, если вообще имеет место. Эти вирусы относятся к различным семействам, даже тип геномной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) не один и тот же. Общее о них только одно – «нацеленность» на печень.  

Гепатит А (раньше у нас его называли болезнью Боткина) и гепатит E это болезни «грязных рук» и «грязной воды». Их возбудителями являются вирусы HAV и HEV, соответственно. Они вызывают только острый гепатит и к этой Нобелевской премии отношения не имеют. 

Гепатиты B, D и С передаются с кровью. Их вызывают вирусы HBV, HDV и HСV, соответственно. Эти заболевания, в отличие от гепатитов А и E, могут быть хроническими. Особенно часто это наблюдается при гепатите С. Вирус гепатита D (HDV) особенный. Он не может размножаться и передаваться без HBV и одна и та же вакцина (из антигена HBV - HBsAg) эффективна против обоих вирусов. В принципе HDV это редкость (относительная). 

Хронические гепатиты B и С приводят к циррозу печени, а на фоне цирроза значительно возрастают шансы развития рака печени. Так что оба, HBV и HСV, онкогенны. Правда, для реализации их онкогенного потенциала необходимы многие годы, даже десятилетия. Против HBV есть хорошая вакцина, но с медикаментозным лечением гепатита В успехи так себе. А против HСV вакцины нет (боюсь, не скоро появится), а вот с медикаментозным лечением гепатита С успехи поразительные.

Предистория открытия

Один из сегодняшних лауреатов - Харви Альтер имеет прямое отношение и к открытию HBV и к открытию HCV. Кстати, за открытие HBV также была присуждена Нобелевская премия по медицине (в 1976г), но тогда ему не повезло, хотя он и был вторым автором первой публикации на эту тему. Когда же дело дошло до Нобеля за открытие HCV не дать премию Харви Альтеру уж никак было нельзя. Хотя и не он идентифицировал вирус, но без его исследований открытие HCV было бы невозможным. 

К середине 1970-х было известно два вируса гепатита – HAV и HBV и имелись надёжные методы диагностики каждого из них. В это время Харви Альтер стал руководителем лаборатории NIH, которая занималась гепатитами, развивающимися после переливаний крови (пост-трансфузионными гепатитами). В своей первой работе на этом поприще Альтер показал, что HAV к пост-трансфузионному гепатиту никакого отношения не имеет, а HBV ответственен только за часть случаев этого типа гепатита (приблизительно половину). Альтер постулировал, что «необъяснённый» пост-трансфузионный гепатит, который он, не мудрствуя лукаво, назвал гепатитом ни-А, ни-В (non-A, non-B hepatitis), вызывается особым вирусом. Засучив рукава, он принялся за поиски этого вируса. Довольно быстро ему удалось выйти на правильную тропу - заразить гепатитом ни-А, ни-В шимпанзе. Заражая шимпанзе и перевивая гепатит ни-А, ни-В на них, Альтер установил многие свойства этого таинственного вируса (маленький размер, наличие липидной оболочки, большое антигенное разнообразие, возможность нейтрализации антителами). Но от «пленения» вирус неизменно ускользал. Его не удавалось культивировать in vitro, обнаружить с помощью электронного микроскопа и других, доступных в то время методов идентификации вирусов. С 1975 по 1989гг. единственным работающим инструментом была модель на шимпанзе. В ходе сложнейшей работы (шимпанзе не мышки!) были получены образцы крови шимпанзе, предположительно, содержащие большое количество искомого вируса, которые Альтер передавал в другие лаборатории (из одного из таких образцов в конечном итоге и был «изолирован» вирус). Параллельно Альтер собрал уникальную коллекцию образцов сывороток людей и шимпанзе, о каждом из которых он знал есть ли в нём или нет «агент ни-А, ни-В» или антитела к нему. Образцы этой коллекции были зашифрованы. Код знал только Альтер. Шли годы, разные исследователи, многие из которых работали с материалами, полученными от Альтера, объявляли об открытии «вируса гепатита ни-А, ни-В». Верификация этих открытий проводилась с помощью зашифрованной коллекции Альтера. Все эти открытия (не менее 20) были закрыты – никто не мог правильно «расшифровать» статус образцов. Но однажды, в 1989 году, Альтеру позвонил George Kuo (один из тех, кто Нобелевскую премию не получил) и сказал, что он думает, что «агент ни-А, ни-В» у них в руках и они могут определять антитела против этого агента. Не питая особых надежд, Альтер отправил зашифрованные образцы, положительные и отрицательные на антитела. Какого же было его удивление и восторг, когда он проверил результаты слепого тестирования, полученные из этой лаборатории. Среди положительных образцов все, кроме двух, были идентифицированы правильно, а среди отрицательных образцов правильно были идентифицированы все. Команда, которая правильно вскрыла «код Альтера», работала в крупнейшей биотехнологической компании Chiron. Её руководителем был Майкл Хоутон (Michael Houghton), а его ключевыми сотрудниками были Qui-Lim Choo и George Kuo. С ними сотрудничал Чарльз Райс (Charles M. Rice), который тогда работал в CDC. Это был момент истины. Вскоре «агент ни-А, ни-В» получил своё нынешнее имя – Hepatitis C Virus (HCV).

Как был открыт вирус гепатита С

За словами «открыть» или «выделить/изолировать» вирус в разные периоды развития вирусологии скрывались разные смыслы. На заре вирусологии открытие вируса означало, что болезнь можно экспериментально перенести от одной особи к другой, используя биологический материал, пропущенный через специальный фильтр, задерживающий бактерии. В этом смысле вирус, который мы теперь называем HCV, Харви Альтер (Harvey Alter) открыл ещё в середине 1970-х. Но к этому времени вирусология шагнула далеко вперёд и для того, чтобы утверждать, что вирус открыт/выделен нужно было продемонстрировать как выглядят вирусные частицы под электронным микроскопом, какой у вируса геном (РНК или ДНК), какие у него антигены и состоит ли он в родстве с уже известными семействами вирусов. Особенно убедительной заявка на выделения вируса выглядела тогда, когда удавалось заразить им клеточную культуру in vitro и «выращивать» в ней вирус. 

В случае «агента гепатита ни-А, ни-В» вирусные частицы под электронным микроскопом не обнаруживались, попытки заразить им клеточные культуры были неудачны и какой у него геном (ДНК или РНК) было неизвестно.  Но начиная с 1973г. бурными темпами стала развиваться генная инженерия. Исследователи научились разрезать ДНК в нужных местах, сшивать её кусочки в требуемом порядке и встраивать их в способные к репликации «организмы» (плазмиды, бактериофаги, вирусы). Вся это «кухня» получила название технологии рекомбинантных ДНК (recombinant DNA technology). Инструменты для всех этих генно-инженерных манипуляций были предоставлены Природой. Но их надо было найти! Одним из важнейших инструментов был фермент, позволявший «перевести» любую РНК в ДНК (РНК-зависимая ДНК полимераза или ревертаза). Благодаря ревертазе исходным материалом для генетических манипуляций могла быть не только ДНК, но и РНК. Кстати, источником ревертазы являются ретровирусы (самый известный их них – ВИЧ). Ещё одно «кстати» - ПЦР на SARS-CoV-2 невозможен без ревертазы. 

Начиная с середины 1970-х годов биотехнологические компании в США стали расти как грибы после дождя. Эти компании активно занимались разработкой новых молекулярно-биологических технологий.  В индустрию пришла «новая кровь» - молодые, амбициозные специалисты с хорошей подготовкой в области молекулярной биологии. Одной из самых крупных среди этих компаний была Chiron Corporation (её уже больше нет).

Команда, работавшая в Chiron, решила не тратить время на «вирусологическую классику», а попытаться «поймать» агента гепатита ни-А, ни-В используя инструментарий технологии рекомбинантных ДНК. Они рассуждали так. Если это вирус, то должны быть вирусные частицы, внутри которых или ДНК или РНК. Вирусные частицы можно сконцентрировать с помощью ультрацентрифугирования. Затем из осадка, полученного в результате ультрацентрифугирования, можно экстрагировать все нуклеиновые кислоты. На случай, если вирус РНК- содержащий, то эту РНК можно превратить в ДНК используя ревертазу. Если всё это сделать, то в руках будет образец вирусной ДНК, которую можно проклонировать. Если затем просиквенировать клоны с вирусной ДНК, то «портрет» генома вируса будет готов. 

Просто? Действительно, почти любой хороший студент, изучающий молекулярную биологию, мог бы предложить такую схему. Но на пути её реализации была масса проблем. Первая – где взять достаточно большое количество вируса? Ведь размножать его никто не умел. С этим помог Альтер. У него была заморожена плазма крови шимпанзе с очень высокими титрами агента гепатита ни-А, ни-В (что было установлено заражением других шимпанзе). Альтер этот материал команде Chiron предоставил. Это было одним из главных факторов, определивших конечный успех. Ультрацентрифугирование в то время уже было рутинной лабораторной операцией. Экстракция всех нуклеиновых кислот из осадка и перевод присутствующей в осадке РНК в ДНК также особой сложности не представляли. Проблема состояла в том, что помимо предполагаемых вирионов в осадке после ультрацентрифугирования было полно «клеточного мусора». Иными словами, исходная ДНК для клонирования состояла в основном из клеточной ДНК и ДНК копий клеточных РНК. Это было подобно «стогу сена» в котором спрятана «иголка». Проклонировать такую смесь технически проблемы не представляло. Но что дальше? Как потом найти «иголку» - клон с вирусной ДНК? Очевидного ответа на этот вопрос не было. Для клонирования была выбрана система, к которой экспрессируется клонированная ДНК, то есть синтезируется соответствующие белки.  Для этого был использован фаг лямбда-gt11. Если в руках у исследователя есть антитела против искомого белка, то всё просто. С помощью таких антител легко идентифицировать клоны рекомбинантных фагов, имеющих вирусную вставку. Но где взять антитела против антигенов предполагаемого вируса – агента гепатита ни-А, ни-В? И здесь было использовано рискованное решение. Группа Chiron применила для этой цели сыворотку больного, перенёсшего пост-трансфузионный гепатит ни-А, ни-В.  Это было «игрой в рулетку». Руководитель этой группы Michael Houghton утверждал, что они не знали, есть в этой сыворотке антитела или нет. Я не исключаю, что эта сыворотка также была получена от Альтера, но в статье никакой информации о её происхождении нет. 

Как бы там ни было, с помощью этой «золотой сыворотки» было проверено около 1 миллиона клонов рекомбинантных фагов.  С сывороткой сработал ОДИН клон. Его лабораторное название было 5-1-1. Довольно скоро стало ясно, что этот клон происходит НЕ из клеточной ДНК или РНК. 5-1-1 мог происходить только от вируса! С этого момента агент гепатита ни-А, ни-В был уже «на крючке». Дальнейшее было делом техники. Вскоре, используя 5-1-1 в качестве зонда, были идентифицированы другие клоны, содержащие вирусные «вставки». Это позволило реконструировать полный геном вируса. Оказалось, что это однонитчатая РНК длиной около 10 тысяч нуклеотидов. Была определена полярность генома (это важный параметр многое говорящий о механизме репликации) и идентифицированы основные гены вируса. Это позволило быстро получить рекомбинантные вирусные антигены и сделать первую тест-систему на антитела против HCV. Всё это было описано в двух статьях, опубликованных в Science в номере от 21 апреля 1989г. Первым автором первой из этих статей (о клонирование и молекулярной идентификации вируса) был Qui-Lim Choo. Именно в этой статье вирус обрёл нынешнее имя – Hepatitis C Virus (HCV). Первым автором второй статьи (о тесте на антитела против HCV) был George Kuo. Последним автором в обеих статьях был Michael Houghton (руководитель этих работ в Chiron). Имя Альтера стояло третьим во второй статье.

Так впервые в истории вирусологии был открыт вирус, которого никто не видел и который никто не умел культивировать. Но это не помешало создать надёжный тест для диагностики этой вирусной инфекции. «Попутно» был открыт совершенно новый подход к идентификации неизвестных вирусов. 

(с) Проф_АФВ

Ошибка

В этом журнале запрещены анонимные комментарии

Картинка по умолчанию

Ваш ответ будет скрыт